Do prije samo pet godina, većina naučnika, osim onih koji su radili na ovoj tehnologiji, nije znala šta se krije iza ovog akronima. Danas, ova tehnologija je skoro pa istisnula prethodne metode manipulisanja genetičkim materijalom, jer je naučnicima neobično laka za upotrebu. Međutim, premda nema dvojbi u značaj i moć ove tehnologije, ona ima i svoje mračne tajne, počev od činjenice da je bila epicentar jednog od najvećih sudskih sporova za patent, do bioetičkih reperkusija njene primjene na ljudima.
Šta je to CRISPR-Cas9?
Iza ove grupe slova, koju čitamo kao „krispr kas devet“, krije se još enigmatičnija grupa riječi: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, a odnosi se na porodicu malih sekvenci – djelića DNK kod bakterija i nekih primitivnih bakterija zvanih arhee (Archaea). Ovi djelići DNK tih primitivnih živih bića su grupisani u „jata“ (tj. „clustered“), ponavljaju se, u pravilnim razmacima su prekinuti i predstavljaju ono što genetičari nazivaju „palindromske sekvence“.
Ove palindromske sekvence su dijelovi DNK kod kojih se sa dvije suprotne strane strane DNK poruka isto čita, nešto kao „Ana voli Milovana“. U genetičkom inženjerstvu su veoma bitne jer upravo ove dijelove „prepoznaju“ specifični enzimi koji imaju sposobnost presijecanja lanaca DNK.
Enzime koji djeluju poput molekularnih makaza nazivamo restrikcijske endonukleaze, dok nam kao molekularno „ljepilo“ koje sastavlja dijelove DNK služe drugi enzimi, zvani ligaze. CRISPR-Cas9 je sistem sekvenci, „slova“ genetičke informacije, koje predstavlja „vodič“ tamo gdje treba presjeći DNK, dok je Cas9 enzim koji radi presijecanje.
Sam sistem ovih kratkih sekvenci i enzima prvi put je zapažen kod bakterija i arhea-bakterija, a evolutivno se kod ovih organizama razvio kao odgovor na napade posebnog tipa virusa – bakteriofaga.
Naime, kao što biljke i životinje imaju svoje viruse koji napadaju njihove stanice, tako postoje i virusi koji su se specijalizirali da napadaju bakterije i arhee te ih uništavaju tako što upišu svoj genetički materijal u genetičkih materijal bakterija. CRISPR-Cas9 je svojevrsni imunološki sistem koji izrezuje virusni genetički materijal.
Razvoj tehnologije
CRISPR-Cas9 tehnologija je na velika vrata svjetske naučne scene ušla 2012. i zasjenila sve starije metode manipulisanja DNK, kakve su cinkovi prsti (eng. zink fingers, ZNF) ili TALEN. Prošlo je 2-3 godine, a naučnici u svim dijelovima svijeta su saznali za postojanje ove tehnike.
Međutim, treba znati da se to sve ipak nije desilo preko noći. Tri nezavisna tima naučnika su otkrila ovaj sistem kod bakterija u periodu osamdesetih i devedesetih godina prošlog vijeka, ali niti su odmah prepoznate mogućnosti ovog sistema niti se, jednom kada su prepoznate, moglo krenuti sa komercijalizacijom metode.
Prvi opis ovih ponavljajućih sekvenci kod bakterije Escherichia coli dao je 1987. Yoshizumi Ishino sa Univerziteta Osaka, da bi grupa holandskih naučnika 1993. pronašla isti mehanizam kod izazivača tuberkuloze, Mycobacterium tuberculosis. Zatim je, nekoliko godina poslije, španski mikrobiolog Francisco Mojica otkrio ovakve sekvence kod nekoliko arhea bakterija i bakterija.
Ovo otkriće tada je bilo zanimljivo samo onima koji su bili usko specijalizirani sa oblast genetike bakterija. U drugim oblastima, naučnici nisu znali za ovako nešto, niti je otkriće ušlo u udžbenike. Razumljivo je da ni medije nisu interesovale „tamo neke“ bakterijske sekvence.
Međutim, te, za CRISPR značajne 2012. godine, u časopisu Science objavljen je rad o tome kako je ovaj bakterijski sistem odbrane programabilan te je moguće kreirati posebne sekvence koje će voditi enzim do tačno određenog, željenog mjesta na ovoj molekuli i isjeći ga. Rad je objavio tim Jennifer Doudna sa Univerziteta Berkeley u Kaliforniji, a osim Jennifer, u ovom radu se istakla i francuska naučnica Emmanuelle Charpentier.
Sistem je bio funkcionalan ne samo kod bakterija, nego i kod drugih organizama, a pokazaće se, i kod čovjeka. Pola godine dana nakon toga, u istom naučnom časopisu, tim predvođen Feng Zhangom sa Broad Instituta MIT (Massachusetts Institute of Technology) i Harvarda predstavlja akademskoj zajednici genetičko inženjerstvo zasnovano na CRISPR-Cas9 tehnologiji, pri čemu je ovaj tim adaptirao i optimitizirao tehniku koju je opisao Doudnin tim.
Genetički inženjering je sve više imao potrebu za editovanjem genoma, uređivanjem DNK, a ne tek izbacivanjem i ubacivanjem gena, kao što se to radilo kod genetički modificiranih organizama (GMO). Naučnici su htjeli imati mogućnost prekrajanja i montiranja DNK, baš kao što se to radi sa filmskim snimcima i upravo iz registra filmske produkcije je i preuzet termin „gene editing“ tj. „editovanje gena“ ili montaža gena. Ovo je danas postalo sinonim za modifikaciju gena te su ovi termini praktično zamjenjivi. Ipak, editovanje gena podrazumijeva veću plastičnost i više mogućnosti.
Jedna od najzanimljivijih mogućnosti korištenja CRISPR tehnologije jeste genska terapija. Naime, ovom tehnikom je postalo moguće „izrezati“ mutirani gen, zamijeniti ga normalnim genom i omogućiti normalan život osobama pogođenim razornim kongenitalnim oboljenjima, poput distrofije, autoimunih bolesti, Huntingtonove horeje, oštećenja vida i sluha. I upravo se na tome danas radi – naučnici pokušavaju pomoću ove tehnike spriječiti, primjerice, Duchenovu distrofiju.
Također, ova tehnologija se može iskoristiti za stvaranje sasvim novog tipa genetički modificiranih usjeva, uopšte, biljaka i životinja, koji ne bi bili transgenetički, odnosno, u njih se ne bi ubacivala DNK drugih organizama.
Rat za patent
Jednom kada je postalo jasno koliko je CRISPR moćna tehnologija, gdje se sve može koristi i kada su se počele nazirati nove upotrebne vrijednosti, svi oni koji su imali udjela u transferu ovog otkrića u svijet primijenje nauke, kao oruđa genetičkog inženjerstva, počeli su se boriti za patent.
Bitka se vodila između spomenutih Fenga Zhanga, Jennifer Doudna i Emmanuelle Charpentier, odnosno, njihovih matičnih institucija: Broad Instituta-Harvard i Univerziteta Berkeley na kojem je radila Doudna i Univerziteta u Beču, na kojem je radila Charpentier u doba saradnje sa Doudnom.
Naučna, ali i šira javnost je sa velikim interesovanjem pratila sudski proces oko dodjele prava na patent, inače „težak“ milione i milione dolara godišnje. Doudna i njene kolege sa Berkeley su požurili da apliciraju za patent, ali je to uradio i Zhang i njegov tim sa Broad Instituta/Harvarda. Glavni problem oko patenta bilo je „ko je bio prvi“: Doudna i njen tim su rad u kojem su demonstrirali upotrebnu vrijednost CRISPR-Cas9 objavili u avgustu 2012. godine, dok su Zhang i njegov tim rad objavili početkom januara 2013.
Sud je patent dodijelio Broad Institutu i Zhangu te je Berkeley uložio žalbu na ovu odluku sa argumentom da su rad objavili nekoliko mjeseci prije. Međutim, Broad Institut tvrdi da su prije počeli sa istraživanjem te da su prvi koristili metodu na ljudskim stanicama i editovali ih, dok je Berkeley samo sugerirao kako bi aplikacija na ljudskim stanicama bila jedna od mogućnosti. Međutim, Berkeley je prvi ispunio zahtjev za patent, ali aplikacija Broada prošla puno brže.
U septembru 2018. sud donosi konačnu odluku da patent pripada Broad institutu te Zhangovoj kompaniji Editas Medicine, ali ni Berkeley i Doudna te kompanije koje je Doudna osnovala – Caribou Biosciences i Intellia Therapeutics - ipak nisu ostali praznih šaka: njima je dodijeljen patent za korištenje RNK sekvenci-vodiča u CRISPR tehnologije.
Sud se u ovom specifičnom slučaju na kraju čak nije ni bavio time koje prvi nadošao na patent, ali utvrđeno je kako nije bilo krađe ideja, nego su obje naučne institucije nezavisno došle do izuma. Još u decembru 2016. godine, patentni zavod SAD je utvrdio da su ove institucije zapravo otkrile različite stvari – Berkeley da se
može koristiti za editovanje DNK kod bakterija, dok je Broad institut/Harvard pokazao kako se tehnika može koristiti i za editovanje eukariotskih stanica – onih koje su kompleksnije nego bakterijske. Berkeleyevi advokati su argumentovali kako ne treba ništa posebno da bi se Doudnin rad primijenio i na komplesnija živa bića, ali je Patetni zavod odbio to kao argument.
Zbog dugačkog sudskog procesa, tehnologiji je jedno vrijeme čak bila u limbu. Broad je besplatno ustupio tehnologiju naučnim institucijama i neprofitnim istraživačima. Stvar je još više zakomplikovana ulaskom još jednog naučnika koji je tvrdio kako je otkrio primjenu CRISPR – Virginijus Šikšnys sa Univerziteta Vilnius u Latviji je ispunio zahtjev za patent par sedmica prije Berkeleya i to ne ide u prilog Berkeleya.
Ipak, kako god – Doudna i Charpentier će, uz Zhonga i Šišknysa, ostati zapamćeni kao „roditelji“ jedne tehnologija koja je obilježila 21. vijek, koji je i inače vijek biotehnologije. Iduća komplikacija koja čeka javnost jeste potencijalna Nobelova nagrada, s obzirom da se ona može dijeliti samo između troje naučnika, a ovdje imamo barem njih četvoro koji ne bi smjeli biti izuzeti, ukoliko se želi izbjeći skandal širih razmjera.
Mračna ili svijetla budućnost?
Skandal u kojem je kineski naučnik He Jiankui u tajnosti koristio tehnologiju CRISPR za editovanje ljudskih embrija ostaće primjer kako se lako može skrenuti u mračne ćoškove biotehnologije ukoliko ostavimo na stranu bioetičke regulative. Ovaj poduhvat neće ostati usamljen: ruski naučnik Denis Rebrikov već najavljuje ponavljanje Jiankuievog eksperimenta CRISPR se može koristiti na somatskim staničnim linijama tj. na diferenciranim stanicama odraslih individua, ali i na embrionalnim stanicama te zametnim stanicama kakve su jajne stanice i spermatozoidi. Ovo potonje znači da se mogu prepravljati osobine, genetičke šifre koje se mogu prenositi na naredne generacije.
Pri svemu tome, CRISPR-Cas9 je izuzetno efikasna tehnologija, pristupačna i relativno jeftina, no ne i savršena: naučnici nikako da usavrše ovu tehnologiju tako da ne pravi greške u editovanju, tzv. „off-target“, rikošet-greške kada enzim izreže i dio genoma na koji ne ciljamo i proizvede neželjene mutacije. Stoga se mnogi pitaju da li će se ova tehnologija ikada moći koristiti u medicini.
Stvaranje „dizajniranih beba“ pomoću ove tehnologije još uvijek je vrlo daleko, bez obzira da li je to nekome san ili horor-film.
