PCR testovi
PCR (pi-si-ar, prema pravilima spelovanja u engleskom jeziku) je akronim za Polymerase Chain Reaction, odnosno lančanu reakciju polimeraze, proceduru koju je 1983. razvio nobelovac Kary Mullis. Ovom metodom naučnici povećavaju broj – vrše amplifikaciju – određenih segmenata nukleinskih kiselina, odnosno nasljednog materijala. Originalno, PCR je bio metoda amplifikacije segmenata DNK, a kasnije je razvijena i inačica koja amplificira RNK. Svrha PCR jeste da se stvori dovoljno genetičke sekvence koja bi se mogla detektovati i analizirati.
Naime, obje ove molekule – i DNK i RNK – predstavljaju nasljedni materijal, s određenim razlikama u strukturi. Obično se DNK sastoji od dva lanca koji imaju različite smjerove i uvijeni su u spiralu, a RNK ima 1 lanca, mada postoje i izuzeci, drugačije molekule. Zajednička „slova“ DNK i RNK su A (komponenta adenin, nukleinska baza po sastavu), G (nukleinska baza gvanin) i C (nukleinska baza citozin). Razlikuju se po tome što u DNK imamo slovo T (nukleinska baza timin), a kod RNK U (uracil). Redoslijed ovih „slova“ određuje redoslijed aminokiselina u lancu proteina, ali i kopiranje genetičke šifre.
Problem je što virusi, za razliku od živih bića, mogu imati samo ili DNK ili RNK kao instrukciju za svoju replikaciju. Mi u našim ćelijama imamo i DNK i RNK, kao što ih imaju i ćelije ostalih živih bića – bakterija, gljiva, biljaka, ali virusi imaju samo ili DNK ili RNK. SARS-CoV-2 ima samo RNK.
Ne ulazeći u detalje izolacije nasljednog materijala i ciklusa PCR te drugih principa na kojima se zasniva ova tehnika, treba skrenuti pažnju da je otkrivanje RNK virusa zasnovano na malo modifikovanoj PCR tehnologiji koju nazivamo RT-PCR, a što je skraćenica od Reverse transcription polymerase chain reaction tj. lančana reakcija polimeraze pomoću reverzne transkriptaze, jednog enzima koji RNK virusi koriste kada pretvaraju naše ćelije u „fabrike“ za proizvodnju svojih kopija. Ovu RT-PCR treba razlikovati od Real-time PCR, tehnike koja također ima skraćenicu RT-PCR, a predstavlja PCR u stvarnom vremenu.
Svi ovi termini, ako niste biološke, hemijske ili medicinske struke, mogu zvučati strašno i teško su prohodni laicima. Međutim, lakše je razumjeti kada imate informaciju da se virusna RNK, da bi se virus kopirao u inficiranim stanicama, primjerice čovjeka, mora prepisati, „učitati“ na DNK čovjeka, što je proces suprotan onome što se obično dešava – DNK se prepisuje na RNK da bi se proizvelo nešto što je kodirano nekim dijelom DNK (taj dio koji kodira zovemo gen). To nešto što se proizvode je protein, a različiti proteini imaju različite uloge u organizmu – neki grade ćelije, tkiva i prostore između ćelija, neki služe da ubrzavaju biohemijske reakcije u organizmu, neki „prenose poruke“.
RT-PCR tehnologija oponaša ono što radi virus kada inficira stanicu – RNK se „upisuje“ u DNK reverzno. Mi jednostavno pretvaramo RNK u DNK, i to ne bilo koju nego u takozvanu komplementarnu DNK (eng. cDNA), koja je na neki način „odraz“ početne RNK molekule, samo pisan suprotnim slovima genetičke abecede. U genetičkoj „abecedi“, stvaraju se parovi baza: adenin i timin, gvanin i citozin tj. citozin je „suprotan“ gvaninu, a adenin je „suprotan“ timinu. Na mjestima gdje je na RNK virusa bio citozin, na komplementarnoj DNK će biti gvanin.
Zatim se ta komplementarna DNK „dogradi“ da se stvori drugi dio lanca DNK molekule, koji je zapravo slika i prilika one naše početne RNK molekule. Onda amplificiramo tu DNK pomoću PCR tehnike i znamo šta se nalazi u uzorku. Jedino što umjesto uracila, slova „U“, ova molekula ima timin, slovo „T“, ali to ne mijenja značenje poruke i naučnici će znati da je ta sekvenca ista. Najvažnije – ovo je metoda koja nam omogućava da detektujemo postojanje RNK u uzorku, a upravo ovo nam treba kako bismo dokazali postojanje virusa.
Kada imamo specifičnu RNK – genetički kod virusa poznat, onda možemo da ga koristimo kao referencu i uporedimo šta smo dobili metodom PCR s već poznatom sekvencom. Indirektno, dokazivajući postojanje RNK specifičnog virusa, dokazujemo i njegovo postojanja. Kineski naučnici su u januaru ove godine dešifrovali RNK virusa i ove podatke ostavili dostupnim drugim naučnicima.
Kako se uzima uzorak za PCR test?
Uzorak se može uzeti na različite načine, recimo nazofaringealnim brisom u kojem se uzorak uzima na stražnjoj strani nosa i grla, što znači pomalo neprijatno guranje alata za uzimanje brisa u nosnicu i to prilično duboko. Alat za uzimanje brisa je malo duži štapić sa vrhom prekrivenim vatom – kao duža verzija štapića za čišćenje ušiju.
Uzimanje uzorka se može raditi uzorkovanjem ispljuvka, sputuma. Američka FDA je sredinom aprila odobrila i uzimanje uzorka pljuvačke za detekciju SARS-CoV-2. Treba znati da i od mjesta i načina uzimanja brisa ovisi njegova preciznost. Neki testovi iz Yale University School of Public Health pokazuju kako je čak uzorak pljuvačke senzitivniji i možda bolji pokazatelj, ali potrebno je još dokaza da se ovo pokaže kao tačno te da se ova metoda nastavi koristiti ili istisne nazofaringealni bris. Uzimanje nazofaringealnog brisa danas je preovlađujuća metoda za ovaj test.
PCR test se koristi iza detekciju virusa na površinama i u aerosolu, a ne samo u živim organizmima.
Za dobijanje rezultata PCR testa, što uključuje izolaciju virusa tj. izolaciju i ekstrakciju virusne RNK, te ciklus PCR mašine, potrebno je nekoliko sati (5-6), a rezultate testirana osoba dobija obično unutar 24h. Ciklusi PCR podrazumijeva cikluse hlađenja i zagrijavanja dobijene DNK molekule u kojima se ona razdvaja na dva lanca pri zagrijavanju i ponovo spaja s dodatnim gradivnim komponentama pri hlađenju, stvarajući tako sve više i više molekula.
Koje su mane PCR testa?
Ovaj test pokazuje da li je neka osoba trenutno zaražena, ali samo pod određenim pretpostavkama: da je uzorak uzet u najpogodniji čas, odnosno da nije uzet prerano. Ukoliko se uzorak uzme prerano, a osoba je inficirana, test će biti lažno negativan. Potrebno je vremena da se u našim ćelijama replicira dovoljno virusa kako bi ga ova tehnika mogla detektovati, odnosno, iako je tehnika vrlo osjetljiva, postoji jedan prag osjetljivosti ispod koje ne detektuje virusni genetički materijal.
Stoga je potrebno praktično svaki dan testirati osobe u samoizolaciji koje imaju epidemiološku indikaciju - da su bile u kontaktu sa zaraženom osobom ili ako dolaze iz nekog pogođenog područja. Tek oko dva dana prije pojave prvih simptoma, PCR test može dati pozitivan rezultat, odnosno, ima dovoljno virusnog materijala za detekciju. Tada osoba postaje i infektivna za druge. Do tada, test može dati lažno negativan rezultat.
S druge strane, PCR test ne razlikuje živog od mrtvog uzročnika – ovo je test koji samo pronalazi specifične genetičke sekvence virusa. Recimo, pronađena virusna RNK na nekoj površini ne znači automatski da je ta površina zarazna tj. da je virus infektivan.
Isto tako, PCR će pokazati prisutnost virusne genetičke sekvence i kod osobe koja je preboljela COVID-19, ali to neće značiti da je osoba ponovo oboljela, nego jednostavno da se u njenom organizmu još nalaze ostaci virusa koji čak i ne moraju biti infektivni. Ali, sve dok se ne pokaže negativan test, držimo da je ta osoba infektivna. Ovdje bi se radilo o lažno pozitivnom testu.
Stoga je kod interpretacije PCR testa potrebno biti oprezan, a postoji čitav niz faktora koji mogu dovesti do lažno pozitivnog ili lažno negativnog testa.
Ovo ide u prilog tome da ove testove mogu raditi samo obučene osobe te da uzorke mogu uzimati samo obučene osobe i da samo stručnjaci mogu interpretirati test te je nesprovodivo da ovakve testove rade osobe koje nemaju biološko-medicinsko znanje.
Serološki testovi: testovi antitijela
Ovdje se radi o testovima za koji se uzima krv i u krvi traže specifična antitijela koja je organizam proizveo kao imunološki odgovor na infekciju virusom SARS-CoV-2 relativno su nešto brži od PCR testa.
Po hemijskom sastavu, antitijela su proteini, koje zovemo grupnim imenom imunoglobulini (Ig). Ima ih nekoliko tipova: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM. Ovo su proteini čija struktura, 3D model, ponešto podsjeća na slovo „Y“, a sama molekula se sastoji iz dijela koji je stalan i promjenljivih regiona, ključnih za vezivanje onoga što zovemo antigen – tvar, patogen, izazivač bolesti ili neki njegov dio na koji organizam reaguje imunološkim odgovorom.
Od trenutka kada organizam reaguje na zarazu, stvaraju se antitijela. Neka antitijela ostaju organizmu još dugo vremena i upravo bi nam ona trebala pružiti imunitet na bolest koju smo preležali. Ovdje su posebno značajni imunoglobulini – antitijela IgG, IgA i IgM. IgM se javljaju u toku bolesti i ostaju i u periodu kada se bolesnik oporavlja, dok se IgG javljaju u početku perioda kada se bolesnik oporavlja i nakon oporavka.
Detekcijom IgG antitijela detektuje se zapravo da li je neko prebolio infekciju i ima li imunitet na specifičnu bolest. Detekcija IgM antitijela znači i detekciju aktivnog oboljenja, ali već u fazi kada se pokažu simptomi ili u fazi oporavka – ne prije, za razliku od PCR teksta koji može pokazati da je osoba inficirana i nekoliko dana prije pojave simptoma, pod preduslovom da ima dovoljno repliciranog virusa u ciljanim ćelijama (u slučaju COVID-19, radi se o ćelijama respiratornog sistema, koje oblažu respiratorne puteve).
Negativni rezultat serološkog ne isključuje da nije došlo do infekcije jer mali broj – sasvim mali procenat - ljudi ne razvije antitijela i njih zovemo „nereaktanti“. No većina ljudi ipak razvije ove proteine, samo ne znamo kako sve to funkcioniše u slučaju COVID-19.
Za sada još ne znamo da li detektovana antitijela na COVID-19 znači i da li je osoba imuna, tj. da li se ne može više zaraziti. Također, ako se formira imunitet, ne znamo koliko dugo traje. To su sve nepoznanice o novoj bolesti koje ćemo otkrivati decenijama nakon 2020.
Šta dalje slijedi?
U budućnosti bismo mogli očekivati i testove koji detektuju antigen virusa – neki protein virusne kapside dovoljno specifičan da bismo, ako ga detektujemo u krvi, znali da je riječ o SARS-CoV-2. Antigenski testovi na ovaj virus još ne postoje, jer naučnici traže koji bi protein bio adekvatan marker za ovu svrhu. Američka FDA je 9. maja autorizirala prvi antigenski test za brzu detekciju SARS-CoV-2.
Testiranja su važna jer ne samo da otkrivaju zaražene osobe, nego pokazuju i da li je neka osoba preboljela infekciju i može li se vratiti na radno mjesto ili, ako je u karantinu, nije inficirana ni nakon očekivanog perioda inkubacije te može izaći iz karantina. Također, posebno u periodu koji dolazi, testovi populacija će biti iznimno važni da se preciznije utvrdi broj oboljelih i procijeni procenat populacije koji je obolio, bio „prokužen“ virusom te potencijalno možda stekao imunost.
Ovo će se raditi serološkim testovima, a ta vrsta testiranje će pokazati i udio asimptomatskih prenosioca, osoba koje su imale vrlo blage simptome ili nisu ni osjetile da su inficirane naspram identificiranih slučajeva. Procjena toga će dati i procjenu koliko je populacije prokuženo novim virusom, ali i promijeniti udio smrtnih i teških slučajeva na ukupan broj slučajeva. Međutim, treba imati na umu da, čak i kada ove procjene, kako očekujemo, smanje mortalitet tj. letalitet od COVID-19, ova bolest je i dalje jedna od top infekcija i novi brojevi neće umanjiti ozbiljnost toga što se dogodilo.
