Sam PCR test na novi virus je zapravo test kojim se regije od interesa genoma virusa SARS-CoV-2 umnožavaju, kao na jednom molekularnom kopir-aparatu. Tako od sasvim male količine genetičkog materijala dobijamo količinu na osnovu koje možemo izvoditi različite zaključke u forenzici, istraživanjima hrane i slično. PCR prvobitno nije bio zamišljen da bude aplikativna metoda, međutim, kao što to obično biva u nauci, novi izumi i metode nađu svoju primjenu, a jedna od primjena PCR-a je i dijagnostika. Odavno se već koristi za testiranje na HIV, ali i za druge biološke materijale.
PCR: kopir-mašina za gene
Specifičnost i senzitivnost PCR metode, odnosno sposobnost jednog PCR testa da razluči pravilno osobe koje imaju prisutnost virusnog genoma SARS-CoV-2 od osoba koje ga nemaju te sposobnost testa da nije lažno pozitivan jeste bila glavna tema tih razgovora. Vrlo su se često mogli čuti strahovi laika da ova metoda može proglasiti svakoga ko se testira pozitivnim ili ako imamo bilo koji drugi virus ili bakteriju da će nam test biti pozitivan. Međutim, niti je to istina, niti PCR test nekoga „proglašava“ pozitivnim ili negativnim – to rade osobe koje tumače rezultat testa. Kako bismo objasnili neke nejasnoće i zablude vezane za PCR test na SARS-CoV-2, obratili smo se dr. Rijadu Konjhodžiću i dr. Damiru Marjanoviću.
Jedna od stvari koja se provlačila jeste i to da su neki PCR testovi bolji, a neki gori tj. manje precizni.
„Naša laboratorija (op.a. Genetički centar „Alea“) koristi CV IVD kitove za testiranje na SARS CoV -2“, govori nam dr. Rijad Konjhodžić. Upitan o testovima o tome koji se testovi koriste u drugim laboratorijama, dr. Konjhodžić kaže da, prema njegovim saznanjima, „svi testovi koji su u opticaju u BiH i imaju registraciju kod Agencije za lijekove imaju i CE IVD“ (European In Vitro Diagnostic Directive).
„Kit“ je naziv za standardizirane reagense, optimizirane za određen protokol, kao jedna vrsta laboratorijskog „paketa“ prilagođenog za neku određenu svrhu. Inače, ono za šta naše laboratorije koriste te već gotove kitove, mogu se koristiti i posebni reagensi, i u laboratoriji optimiziraju protokol testa tj. kako bismo to jednostavnije objasnili, njegove korake i „recepturu“.
PCR test na ovaj virus nije, kako neki zamišljaju neka tračica koja pokaže rezultat – radi se o hemijskoj reakciji koju naučnici vode pomoću određenih reagenasa i „prajmera“ – što su zapravo dijelovi genetičke poruke koji započinju reakciju prilikom „kopiranja“ gena. Najprostije rečeno, PCR metoda je „ringla“ na kojoj zagrijavamo i hladimo uzorak, uz potrebne hemikalije u određenom broju ciklusa. Preporuka broja ciklusa varira od proizvođaca kita i protokola, kao i od vlastitog iskustva laboratorije, ali generalno 35 – 40 ciklusa je neki standard u ovom slučaju.
Međutim, ovom tehnikom ne kopiramo cijeli genetički materijala virusa – to bi oduzelo mnogo resursa. Zato su naučnici još na početku pandemije pokazali koji su to dijelovi genetičke poruke virus najpodobniji za PCR – da kada njih dobijemo u uzorku, znamo da je riječ o ovom virusu.
„Postoji više specifičnih genskih regija kod SARS-CoV-2 virusa koje mogu biti target PCR testiranja“, objašnjava Konjhodžić i nastavlja: RDRP, Orf1, E i N su najčešći, a koji se rade ovisi i o propisima pojedinih regija -npr, EU traži test E i N gena, WHO savjetuje skrining sa E gen prajmerima, uz potvrdu pozitiviteta sa RDRP gen prajmerima, itd“.
Ipak pored ovih razlika u tome šta su preporučeni ciljani geni, Konjhodžić naglašava da se pozitivan uzorak testira pozitivno na svim genima.
Lažno negativni i lažno pozitivni testovi
Najvažnija pitanja oko ovih testova jesu pitanja lažno negativnih i lažno pozitivnih testova. Istina je da niti jedan test nije savršen i da svaki daje mali procenat pogrešnih rezultata. Kada osoba dobije negativan PCR test na novi koronavirus, a za neko vrijeme se utvrdi da je osoba inficirana, to može imati različite uzroke: recimo, može biti da je test uzet prerano.
Naime, premda je PCR tehnika jako osjetljiva, postoji određen prag ispod kojeg neće „reagovati“. U prvi danima nakon izlaganja virusu, manja je vjerovatnoća da će PCR detektovati virusne gene. Kako se odmičemo od tog nultog dana kontakta s virusom, tako raste vjerovatnoća da će biti detektovan, jer se virus sve više i više umnožava u stanicama. Najveća vjerovatnoća detekcije je zapravo onda kada se pojave prvi simptomi.
Preciznost 48 sati nakon infekcije virusom se procjenjuje na 50% i malo ispod, ukupna preciznost iza 5 dana raste na preko 75%, s tim da preciznost kod pacijenata koji pokazuju simptome raste i na preko 90% u tom periodu.Dr. Rijad Konjhodžić
"Na tom nivou ostaje jedno vrijeme, da bi onda počela opadati.“, kaže dr. Konjhodžić, osvrćući se na ovaj problem.
To ujedino i jeste razlog zašto se ne testiraju svi odmah, nego se čekaju simptomi. Još jedan od razloga lažno negativnog testa može biti i to da je bris uzet prekasno – jer se virus iz nosa povlači prema plućima, pa ga je manje u nosnoj sluznici. Treći razlog može biti i nestručno uzimanje brisa – bris je potrebno uzeti sa zadnje strane unutrašnosti nosa, što nije prijatno, ali je veća garancija da je uzorak reprezentativniji. Zato osobe koje uzimaju uzorak „ne štede“ osobe od kojih uzimaju i ova procedura nije ugodna.
Međutim, ljudi se veoma boje lažno pozitivnog rezultata testa. To znači da će morati u izolaciju, koja u bosanskim uslovima često i nije praktično izvodiva, da neće moći izlaziti vani. Ako se to desi zbog toga što test nije bio valjan, jasno je da ovo izaziva bijes, negodovanje i strah. Već je bilo slučajeva da se osobe na jednom testu pokažu pozitivnim, a na drugom, urađenom samo par dana kasnije ili u drugoj laboratoriji, negativnim. Ovakve situacije se mogu odraziti kako na privatnu, tako i na poslovnu sferu pojedinca.
„Uzroci lažno pozitivnog testa za SARS-CoV-2 virus su jednaki kao i za bilo koju drugu RT PCR analizu, a većinom se tiču kontaminacije i/ili zamjene uzorka“, objašnjava Konjhodžić. „Također, postoji mogućnost nespecifičnosti prajmera, u kojem slučaju bi se moglo detektovati prisustvo srodnog virusa, u slučaju SARS CoV 2 testiranja, mogući krivac bi bio HKU1 virus, koji je takodjer betakoronavirus i zamijeniti ga sa SARS-CoV-2“.
„Važno je napomenuti da pozitivan PCR test ne znači nužno i potvrdu infekcije, naime, PCR ne razlikuje aktivne viruse (op. a. oni koji se mogu umnožavati i inficirati ćelije) od razorenih, čija nukleinska kiselina i dalje može dati pozitivan PCR rezultat“, nastavlja dr. Konjhodžić. Zabilježeno je da pojedini pacijenti mogu imati pozitivan PCR nalaz dugo nakon prestanka simptoma. Upravo je to i razlog promjena zahtjeva o retestiranju osoba koje su bile u izolaciji jer period prisustva neaktivnog virusnog materijala može biti dug.
Ljude se boje i da je ovdje riječ o nekoj namještaljici kod lažno pozitivnog testa te prof. dr. Damir Marjanović naglašava kako nije test lažan nego jednostavno pokazuje ostatke nečega što je tu bilo, ostatke virusa.
„Bitno je objasniti da se ne radi o nekom „lažno pozitivnom testu“ koji prikazuje da je prisutno nešto čega nema, naprotiv, PCR test je dizajniran tako da detektuje prisustvo specifičnog genetičkog materijala. U analizama humane DNK, ove metode su korištene za detekciju i kreiranje genetičkih profila iz skeletnih ostataka čak i za osobe koje su umrle prije nekoliko hiljada godina“, objašnjava dr. Marjanović.
„U svakom slučaju PCR test ne daje 'lažno pozitivne rezultate', ali on u ovome momentu, ovako dizajniran, samo potvrđuje prisustvo genetičkog materijala, te se na osnovu njega ne može ustvrditi da li se radi o prisustvu većih ili manjih količina vijabilnoga virusa, ili pak samo o genetičkim fragmentima koji potiču od tog virusa, naglašava Marjanović.
Pozitivni PCR rezultat je svakako dokaz da je ta osoba imala kontakt sa SARS CoV 2 virusomDr. Damir Marjanović
Sam pozitivan rezultat PCR analize nije dostatan da da predikciju da li će neko imati simptome COVID-19 bolesti, i da li će ti simptomi biti lakši, srednji ili teži. PCR-om se, za sada samo detektuje prisustvo ili odsustvo genetičkog materijala virusa. „Dalja istraživanja bi mogla ovo oruđe načiniti informativnijim, ali mislim da bi u ovome momentu PCR trebao da ostane to što jeste – metod za detekciju prisustva ili odsustva genetičkoga materijala koji se ispituje“, decidan je Marjanović.
Postoji još jedna interesantna situacija vezana za testiranja, a to su granični slučajevi nalaza. Na pitanje šta u njegovoj laboratoriji rade kada dobije ovakve rezultate, dr. Rijad Konjhodžić kaže sljedeće: „Generalno, univerzalni lijek je ponovno testiranje kroz 24/48 sati. Ukoliko smo uhvatili tranzitornu ili prolazeću infekciju, ona će na retestu biti negativna. Ukoliko smo uhvatili početke, za 24 sata ce već biti jasno vidljiva“.
Vrijednost koja se najviše spominje kao granična je 100 kopija (gen od interesa) po mililitru transportnog medija, kod izrazito senzitivnih kitova, mada postoje operativni kitovi čiji je senzitivitet manji. „To generalno nije problem, jer smo svjedoci debate da se prag pozitiviteta povisi“, dodaje Konjhodžić.
Ovo će se vjerovatno i desiti, kako napreduju saznanja o virusu, njegovoj detekciji i samoj bolesti. Trenutno je stvorena fama oko PCR tehnologije i testova baziranih na njoj jer većina ljudi prije nije čula za ovu tehniku i ne razumije način na koji ona funkcioniše. Nakon prvog vala informacija, ljudi su počeli zamišljati da je ovaj test „svevideći“ ili da predviđa i da će osoba imati teške simptome.
Međutim, moramo početi razlikovati stanja „pozitivan test“ i bolest te razumjeti ono najbitnije. PCR je dizajniran da detektuje prisustvo specifičnog genetičkog materijala, u ovom slučaju, materijala SARS-CoV-2, ali ne može razlučiti da li su to samo fragmenti zaostali nakon raspada virusa ili je virus u stanju da se replicira i nastavlja inficirati ćelije.
